专题1　基因工程

1．1　DNA重组技术的基本工具

1．基因工程是在　DNA分子　水平上进行设计施工的，因此又叫做　DNA重组　技术，这种技术是在生物体外，通过体外　DNA重组　和　转基因　等技术，赋予生物新的遗传特性。

2．基因操作的工具包括基因的"剪刀"――　限制性核酸内切酶　；基因的"针线"――DNA连接酶　；基因的"运输工具"――　运载体　。

3．限制酶主要来源于　原核生物　。限制酶的作用特点是能够识别DNA中　某种特定的核苷酸序列　，切开两个　核苷酸　之间的　磷酸二酯键　。限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：　黏性末端　和　平末端　。

4．DNA连接酶的作用是　将双链DNA片段连接起来　，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的　磷酸二脂键　。根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：　T4DNA连接酶和　E.coliDNA连接酶　。

5．目前基因工程中经常使用的运载体有　质粒　、　动植物病毒　和　λ噬菌体的衍生物　。

6．质粒是一种　裸露的　、　结构简单　、独立于　细菌染色体　之外，并具有　自我复制　能力的　双链环状　DNA分子。

7．作为基因进入细胞的载体，必须具备的条件是　能在宿主细胞中复制并稳定保存　、具有一至多个限制酶切点　、　具有某些标记基因　、　对宿主的生存没有决定性的作用。

1．2　基因工程的基本操作程序

1．基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：　目的基因的获取　、　基因表达载体的构建　、　将目的基因导入受体细胞　、　目的基因的检测与鉴定　。

2．目的基因主要是指　编码蛋白质的结构基因　，也可以是一些　具有调控作用的因子。获取目的基因的途径有　从基因文库中获取、　利用PCR技术扩增获得　、　直接人工合成　。

3．PCR是利用　DNA双链复制　的原理，将基因的核苷酸序列加以复制，使其数目呈　指数　方式增加。需要的前提是　要有一段已知目的基因的核苷酸序列　，扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，　引物与单链　相应互补序列结合，然后在　DNA聚合酶　的作用下进行延伸，如此重复循环多次。

4．基因工程的核心是　基因表达载体的构建　，其目的是　使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用　。

5．一个基因表达载体的组成有：　目的基因　、　启动子　、　终止子　和　标记基因　。

6．将目的基因导入植物细胞的方法有　农杆菌转化法　、　基因枪法　和　花粉管通道法　。采用最多的方法是　农杆菌转化法　，通过农杆菌的转化作用，就可以使　目的基因　进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中的　染色体DNA　上，使　目的基因　的遗传性状得以稳定维持和表达。

7．基因工程选取原核生物作为受体细胞的原因是由于其具有其他生物没有的一些特点，如　繁殖快　、　多为单细胞　、　遗传物质相对较少　等

8．大肠杆菌常用的转化方法是：先用　Ca2+ 处理细胞，再将　载体DNA分子溶于缓冲液中　与此种细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

9．检测目的基因是否成功插入到转基因生物的染色体上的方法是采用　DNA分子杂交技术　，此方法使用的探针是　同位素标记的含有目的基因的DNA片段　，与检测目的基因是否转录出mRNA所用的探针　一样　。检测目的基因是否翻译成蛋白质，检测方法是从转基因生物体内提取蛋白质，用相应的　抗体　进行　抗原－抗体　杂交，若有　杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。除了上述的分子检测外，有时还需要进行　个体生物学水平　的鉴定，如对抗虫植物做抗虫的接种实验。